Біологічні дослідження

КОМПЛЕКСНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИЙ АНТАРКТИЧЕСКИХ НАЗЕМНЫХ МИКРОБНЫХ ЦЕНОЗОВ

Доповідь (word)

Презентація (pdf)

Презентація eng. (pdf)

Аудіо презентація (rar)

Рис. 1. С начала ХХ века и по настоящее время микробиологические исследования в Арктике и Антарктике в основном направлены на поиск и изучение экстремофильных микроорганизмов.

Классические методы, общепринятые в геологической, водной и почвенной микробиологии, к сожалению, практически не использовались при исследовании антарктических микроорганизмов.

Именно поэтому в 2001 г. мы приступили к комплексным исследованиям структуры и функций антарктических наземных микробных ценозов.

Рис. 2. Главным объектом исследований является биогеографический полигон на о. Галиндез в 20 минутах ходьбы от станции Академик Вернадский.

На полигоне на протяжении 9 лет проводятся комплексные биологические и геодезические исследования: отбор образцов, картирование биотопов и т.д.

Рис. 3. Полигон - это скалистый мыс высотой 58 м. Вверху скалы сливаются с реликтовым ледником, переходят в обширные моховые поля с почвой и гнездовьями птиц, и далее – в скальные обрывы высотой 10 -15 метров. Внизу полигона находится озеро с мощными иловыми отложениями.

Рис. 4. С помощью GPS и GIS-методов создана топографическая карта и 3D-модель полигона. На их отражены основные ландшафтные элементы, типовые биотопы и сеть позиционированных точек длительного мониторинга – 150 точек.

Проведены геохимические исследования по содержанию 20 элементов, концентрации общего углерода и почвенных гуминовых кислот.
   
Рис. 5. Полигон представляет собой субполярный термостатированный оазис, на котором имеются все виды биотопов – ледовые водорослево-бактериальные пленки, накипные лишайники, почва, мох, трава, и т.д.

Рис. 6. Главным результатом и достижением микробиологических исследований является то, что впервые на репрезентативном объекте, субполярном антарктическом оазисе, изучены структура и функции антарктических микробных ценозов. Комплексные исследования проведены классическими методами общей, почвенной и геологической микробиологии в сочетании с современными методами стереометрического моделирования. 

Для Антарктики характерны низкие температуры и малое содержание органических соединений в биотопах. Поэтому считается, что там преобладают психрофильные олигокарбофилы, т.е. микроорганизмы, растущие при низких температурах и малом содержании органических веществ. Это действительно подтвердилось при количественном учете физиологических групп микроорганизмов.

Однако мы установили, что в почвах полигона в высокой концентрации также присутствуют микроорганизмы, растущие при средней и высокой концентрации углерода (т.е. мезотрофы и копеотрофы).

Кроме того, в почве широко распространены не только психрофильные, но и мезофильные, и даже термофильных микроорганизмы (т.е. растущие при температурах 25 и 45 оС соответственно).

По-видимому, широкое распространение на полигоне копеотрофых и термофильных микроорганизмов связано с орнитофауной.

Рис. 7. Новым и важным результатом является принципиальное сходство структуры микробных ценозов субполярного оазиса и регионов с умеренным климатом (условно – «европейские почвы»). Иначе говоря, и в антарктических, и в «европейских» почвах присутствуют все указанные эколого-трофические группы: автохтонные, зимогенные, и т.д.

Концентрация микроорганизмов в этих группах высокая, - в среднем от 105 до 106 степени клеток на 1 г образца.

Отличия заключаются в том, что в целом концентрация хемоорганотрофных микроорганизмов в антарктических почвах на 2-3 порядка меньше, чем в почвах Европы. Также закономерно, что в почвах полигона количество целлюлозоразрушающих микроорганизмов мало, т.к. высшие растения не образуют сплошного покрова.

Рис. 8. В антарктических почвах присутствуют все физиологические группы микроорганизмов, необходимые для функционирования полного, замкнутого редокс-цикла углерода, от СО2 и до СН4. О потенциально высокой биогеохимической активности микроорганизмов цикла углерода свидетельствует их высокая концентрация, - 104 – 106 клеток/г образца.

Рис. 9. Аналогичные закономерности получены и для микробного цикла азота. Цикл азота также замкнутый (от азота5+ до азота3¬-). Концентрация клеток также высокая, 104 – 106 клеток/г образца.

Диверсификация физиологических групп цикла углерода и азота, а также высокая концентрация микроорганизмов позволяют предположить, что они существенно влияют на интегральные потоки элементов. И прежде всего – на вовлечение СО2 и атмосферного азота в биогеохимические циклы в антарктических биотопах.
   
Рис. 10. Важной характеристикой микробных экосистем является их гомеостаз, т.е. способность сохранять стабильность при воздействии экстремальных, или стрессовых факторов.

К таким факторам относятся УФ-радиация, органические ксенобиотики, антибиотики и тяжелые металлы.

Мы выбрали для определения количественных параметров гомеостаза антарктических микроорганизмов в качестве индикаторного стресс-фактора медь в форме двухвалентного катиона Cu2+, т.к. это сильный ингибитор. Ожидалось, что уже при концентрации 5 – 10 мг/л будет проявляться полное подавление роста микроорганизмов, - т.к. в этом диапазоне медь является бактерицидной для подавляющего большинства хемоорганотрофных микроорганизмов.

Рис. 11. Однако неожиданно мы обнаружили явление металлрезистентности. Антарктические микроорганизмы оказались весьма устойчивыми к этому стрессовому фактору. При 200 мг/л меди количество клеток снижалось на порядок. Однако дальнейшее 5-кратное повышение концентрации меди (с 200 до 1000 мг/л) практически не влияло на микроорганизмы; их концентрация даже при 1000 мг/л Cu2+ составляла десятки млн. кл./г почвы.

Этот факт свидетельствует о сверхустойчивости антарктических почвенных микрооргаизмов к меди.

Рис. 12. Медьрезистентные микроорганизмы широко распространены на полигоне. Они обнаружены во всех биотопах полигона, таких как скалы, накипные лишайники, мох, трава, почва, озерные илы. Их количество в составляет 105 – 106 клеток/г образца.

Рис. 13. Для микроорганизмов характерно явление «сцепленной» устойчивости к нескольким токсичным металлам. Токсичные металлы представлены 20 элементами, но мы выбрали в качестве «индикаторных» - 3 наиболее токсичных металла: ртуть, кадмий и хромат. Это сильнейшие металлы-заместители и металлы-окислители, и уже при концентрации 10 мг/л подавляют рост микроорганизмов.

Оказалось, микроорганизмов полигона характерна полирезистентность. В биотопах полигона, таких как мох, озерный ил и почва широко распространены микроорганизмы устойчивые к Hg, Cd и Cr. 

Количество микроорганизмов составляло 103 – 105 клеток/г образца клеток при сверхвысоких концентрациях металлов: 50 мг/л Hg, 500 Cd и Cr.

Т.о., в антарктическом субполярном оазисе широко распространены микроорганизмы, устойчивые к 4 наиболее токсичным металлам при их концентрациях, на 1-2 порядка превышающих бактерицидные.

Отсюда следует, что эта экосистема характеризуется высоким уровнем гомеостаза - устойчивости к металлам, как стрессовым факторам.

Рис. 14. Из почвенных образцов полигона выделены 10 штаммов, устойчивых к запредельно-высоким концентрациям 5 самых токсичных металлов. Эти культуры способны расти в присутствии 500 мг/л Hg2+, 1000 Co2+, 2000 Ni2+, 2500 Cu2+ и 60000 Cr(VI).
 
Рис. 15. Несмотря на сверхустойчивость этих штаммов к металлам, повышение концентрации металлов приводит к ингибированию роста. Однако для большинства гетеротрофных микроорганизмов «ингибирующая» концентрация металлов около 10 мг/л, а для наших штаммов – тысячи и десятки тысяч мг/л.

Так, в диапазоне от 500 до 30000 мг/л Cr(VI) количество выросших штаммов снижалось от 10 до 3, а при 40 г/л до 0. Дополнительные источники углерода и энергии повышают устойчивость культур. В присутствии глюкозы даже при 60 г/л Cr(VI) растут 2 из 10 штаммов. 
   
Однако нам не удалось установить для хрома(VI) LD100, - т.е. летальную дозу, вызывающую 100% гибель всех 10 коллекционных штаммов.  

2 штамма хорошо росли даже при концентрации насыщения Cr(VI) в среде - 60 г/л. Больше хромат в среде просто не растворялся.  

Явление множественной устойчивости хемоорганотрофных микроорганизмов к наиболее токсичным металлам в концентрационном диапазоне от нескольких граммов в литре и до десятков граммов до сих пор еще никем не было описано. 

Рис. 16. Очевидно, металлрезистентные микроорганизмы принимают участие в биогеохимических циклах металлов в Антарктике. Нами установлены 3 вида взаимодействия антарктических микроорганизмов с металлами:

1. Восстановление и образование нерастворимых соединений:
   – восстановление хромата до гидроксида хрома(ІІІ);
   – восстановление железа(ІІІ) и осаждение в виде сульфида;
   – восстановление меди(ІІ) до нерастворимой закиси меди.
2. Мобилизация металлов:
   – растворение гидроксида меди микробными метаболитами.
3. Иммобилизация металлов.
   – накопление меди(ІІ) и железа(ІІІ) в колониях растущих микроорганизмов.

Рис. 17. Как говорил Луи де Бройль, «каждый успех нашего знания рождает больше проблем, чем решает их».

Поэтому вполне закономерно у нас возникло несколько ключевых вопросов по металлрезистентности антарктических микроорганизмов.

1. Почему устойчивость микроорганизмов к металлам в тысячи раз выше, чем их концентрация в биотопах
   - высокий уровень адаптации, или мы имеем дело с ретро-формами микроорганизмов времен неотектонической активности?
2. Какой предел устойчивости к металлам на других островах и на самом континенте, - на Антарктическом полуострове?

Рис. 18. Нами изучена металлрезистентность микроорганизмов на 19 позиционированных объектах в зоне внутреннего островного шельфа размером 30×60 км.

Результаты:

1. Металлрезистентные микроорганизмы обнаружены на всех 19 объектах.
2. Микроорганизмы растут при высоких предельно-допустимых концентрациях 6 самых токсичных металлов: 5000 мг/л Cr, 2000 Ni, 1000 Cu и Co, 500 Cd и 100 Hg.
3. Доказана полирезистентность микробных ценозов.

Выводы:

1. Установленные закономерности по устойчивости антарктических микроорганизмов к металлам являются общими как для полигона на о. Галиндез, так и для 19 объектах в зоне островного шельфа.
2. Устойчивость к металлам микробных ценозов – распространенное явление на внутреннем островном шельфе Антарктического полуострова.
3. Антарктические биотопы являются стабильным источником штаммов для создания новых биотехнологий очистки металлсодержащих сточных вод и повышения добычи цветных или драгоценных металлов.  

Рис. 19. [Красной линией показано, что…] в большинстве случаев повышение концентрации металлов на порядок (от 20 до 500 мг/л) не приводит к снижению количества жизнеспособных клеток. 

Это свидетельствует о высокой адаптивной способности антарктических микроорганизмов к металлам, как стрессовым факторам.

Рис. 20. Металлрезистентные микроорганизмы широко распространены в биотопах внутреннего островного шельфа, таких как почва, мох, лишайники, гумус и озерный ил. 

Исследовано более 250 образцов на наличие микроорганизмов, устойчивых к Hg, Cr и Cd. Показано, что от 30 до 85% образцов содержат микроорганизмы, устойчивые к «бактерицидным» концентрациям этих металлов.

Рис. 21. Полученные данные по структуре и функциям антарктических микробных ценозов привели нас к следующим выводам.

1. Ценозы диверсифицированы по физиологическим и эколого-трофическим группам.
2. Они проявляют высокий уровень адаптации и устойчивости к металлам, как экстремальным факторам.
3. Ценозы исследованных биотопов сходны между собой по структуре и функциям.

На этом основан ход дальнейших исследований, а именно:

1. Локальные микробные ценозы субполярных оазисов являются репрезентативными индикаторными экосистемами, отражающими реакцию всей субполярной биоты на действие экстремальных факторов (в т.ч. и климатических).
2. Устойчивость ценозов к металлам предполагает возможную устойчивость к комплексу других экстремальных факторов, - УФ-радиации, антибиотикам, и т.д.
3. Индикаторная микробная экосистема должна быть компактной (малая площадь) и максимально открытой для действия комплекса экстремальных факторов.

По этим критериям наиболее подходят 2 экосистемы: 
1 - микробные ценозы вертикальных скал, и 2 – микробные ценозы ледников. 

Рис. 22. На полигоне позиционированы два скалодрома высотой 10-15 м. Это настоящий «вертикальный» оазис. Скалы укрыты мощным биологическим слоем. 

Скалы круглый год открыты для УФ-радиации. Неравномерное распределение органики стимулирует конкуренцию микроорганизмов за субстрат, отсюда - синтез антибиотиков. Наконец, микроорганизмы выщелачивают из пород токсичные металлы.

Рис. 23. По данным GPS-съемки построена 3D-модель Скалодрома-2. На 2 вертикальных профилях заложены 12 точек (Т-ск-0… Т-ск-11).  

По точкам отобраны образцы, и проведен их микробиологический анализ.

Рис. 24. В наскальных образцах частота встречаемости пигментированных форм, их общее количество, а также биоразнообразие значительно выше, чем в других биотопах полигона. 

Из образцов выделены бактерии, дрожжи и микромицеты, окрашенные в черный, коричневый, красный, розовый и желтый цвет. В среднем количество пигментированных микроорганизмов находится в пределах 103 - 106 кл./г образца. 

Очевидно, что пигментированные микроорганизмы скальных биотопов являются потенциальными продуцентами биологически активных веществ, таких как меланины, каротины, флавины, и др. 

Из типовых штаммов создана коллекция хемоорганотрофных микроорганизмов скальных биотопов. 10 штаммов исследованы на устойчивость к УФ-радиации и токсичным металлам.

Непигментированные формы чувствительны к действию УФ, - для них сублетальная доза (LD99,99) - составляла 40 Дж/м2. 

Пигментированные формы, как и предполагалось, в десятки раз более устойчивы к УФ. Для розовых Methylobacterium LD99,99 = 300, а для красных и черных дрожжей - 1500 Дж/м2.

Рис. 25. Типовые штаммы, выделенные на среде без металлов, проявили высокий уровень устойчивости к 5 металлам. В ряду устойчивости указаны максимальные концентрации металлов, при которых возможен рост микроорганизмов. 

Получены следующие значения концентраций:
Hg2+ – 50 мг/л, Co2+ – 150, Ni2+ и Cu2+ - 1250, Cr(VI) - 10000 мг/л.

Несмотря на высокую устойчивость к металлам, повышение концентрации металлов закономерно приводит к снижению количества выросших штаммов. 

Однако, для трех металлов - Ni2+, Cu2+ и Cr(VI) предельные концентрации пока что не установлены, это дело в ближайшего будущего.

Рис. 26. Неравномерное распределение органики в биотопах приводит к конкуренции микроорганизмов за субстрат и далее – к антибиозу.

Антитбиоз проявляется как в синтезе антибиотиков микроорганизмами, так и в устойчивости к этим антибиотикам. 

Из антарктических биотопов выделена культура Pseudomonas putida, подавляющая рост условно-патогенных микроорганизмов. 

Интересно отметить, что при оптимальной температуре роста (+ 26 о С), антибиотическая активность была минимальной, а при неблагоприятной (+ 4 о С) – активность резко возрастала.

Две антарктические культуры Enterobacter hormachii и Brevibacterium antarcticum проявили устойчивость к 9 антибиотикам широкого спектра действия. Они вызывают повреждение ЦПМ и подавление синтеза белка.
Работы по исследованию синтеза антибиотиков и устойчивости к ним антарктических микроорганизмов начаты совсем недавно, однако первые полученные данные свидетельствуют о существовании антибиоза в антарктических биотопах.
   
Рис. 27. Второй индикаторной экосистемой являются микробные ценозы ледников. 

Во время теплого полярного лета, на поверхности ледников активно развиваются двухкомпонентные микробные ценозы, состоящие из фотосинтетических и хемоорганотрофных микроорганизмов.

Фотосинтезирующие микроорганизмы фиксируют N2 и парниковый газ - СО2, а также продуцируют органические соединения (биомасса фотосинтетиков).

Гетеротрофные микроорганизмы разлагают биомассу фотосинтетиков до биогумуса и при этом синтезируют парниковые газы – СН4 и СО2. Биогумус образует на ледниках стабильные векторные потоки углерода.
Таким образом, на громадных территориях субполярной Антарктики происходят глобальные процессы трансформации соединений углерода.

Кроме того, очевидно, что ледовые микроорганизмы на поверхности снега и льда реагируют на атмосферные и др. климатические изменения.

Следовательно, микробные ценозы ледников представляют собой индикаторные экосистемы и могут быть эффективно использованы: 
- для оценки влияния глобальных климатических факторов на антарктические экосистемы а также 
- для изучения закономерностей образования и транспорта органических соединений и оценки баланса     парниковых газов в субполярной Антарктике.


Рис. 28. Нами разработаны природоохранные биотехнологии по переработке твердых пищевых отходов и очистке сточных вод для станции Академик Вернадский.

Технологии основаны на способности антарктических микроорганизмов адаптироваться к неблагоприятным условиям среды и чужеродным органическим соединениям, в т.ч. и к указанным антропогенным отходам.  
Технология переработки пищевых отходов внедрена на станции еще в 2004 г., а технология по очистке сточной воды – подготовлена к внедрению. 

Эти технологии являются универсальными, и могут использоваться в мегаполисах для эффективного решения стратегической задачи – утилизации органических отходов свалок и очистки токсичного фильтрата.

Рис. 29. В настоящее время на всех уровнях активно дискутируется проблема соотношения фундаментальных и прикладных исследований в Антарктике.  

Законодательный уровень – это решения АТСМ, СЕР, Мадридский протокол, и т.д. 

Научно-организационный – это формирование приоритетных направлений исследований в международных программах (таких IPY, 7FP, CAREX) и их последующее финансирование.

Прикладной – это биоразведка и биобезопасность, и т.д.

На этих уровнях принимаются стратегические решения, которые на долгие годы предопределяют все виды деятельности человека в Антарктике. И ошибочные решения здесь недопустимы.

Каково же единственно верное методологическое решение? На этот вопрос ответил Фрэнсис Бэкон еще в 1620 г.:

«Что в теории причина – то средство для практики. Только знание причины явлений дает человеку в руки и средство управлять ими. А находить причину явлений нас учит только опыт. 

Но опыт может быть двоякий: существует experimenta fructifera, опыты плодоносные, когда человек в погоне за ближайшей пользой нередко вовсе не достигает цели или осуществляет немногое. 

Существуют и experimenta luciifera, опыты светозарные, в которых, не руководствуясь узкой целью, он стремится только к объяснению явлений и в результате освещает обширные области фактов.  

И тогда человек есть Homo naturae minister et interpres – истолкователь природы и ее властелин!».  

Рис. 30. Отсюда очевидно, что единственно верный методологический поход – это изучение явления, и лишь затем – его практическое применение в соответствии с установленными свойствами.
И для подтверждения приведем только один пример из наших исследований в Антарктике.

При изучении структуры и функций микробных ценозов →
→ исследовали влияние экстремальных факторов, в т.ч. УФ-радиации →
→ провели скрининг пигментированных форм микроорганизмов →
→ создали коллекцию пигментированных штаммов, среди них N. nigra → 
→ изучение свойств N. nigra – показало устойчивость к токсичным металлам и синтез противоязвенных и противраковых соединений.

Практическое использование свойств только одной этой культуры приведет к созданию новых биотехнологий извлечения токсичных металлов и внедрению новых лечебных препаратов.

Рис. 31. Исходя из изложенного, нами сформулированы следующие стратегические перспективы микробиологических исследований в Антарктике.

Исследования планируются на трех уровнях:
Микроорганизмы – Явления - Процессы 

Микроорганизмы: - изучаются физиологические, эколого-трофические и др. группы
- создаются коллекции штаммов

Явления: - изучается гомеостаз ценозов при действии комплекса стрессовых факторов

Процессы: - изучается роль микробной биоты в глобальных биогеохимических и климатических процессах. 

Практическое применение базы данных сводится к следующей схеме:

Микроорганизмы: - создаются коллекции штаммов – продуцентов биологически активных веществ (БАВ)

Явления: - создаются природоохранные биотехнологии и биотехнологии получения БАВ 

Процессы: - создаются модели прогнозирования биогеохимических и климатических процессов.

Благодарю за внимание!